主题：【第十七届原创】常规液相反相色谱柱的安装及使用维护

常规液相反相色谱柱安装及使用维护

一、何谓常规反相色谱柱

在硅胶或杂化基质颗粒上键合了如C18、C8、C4或苯基等键合相的色谱填料所装填的色谱柱，按反相色谱条件进行操作和分离。反相是液相色谱中常使用的分离模式，而C18柱是常使用的反相色谱柱之一。

二、新色谱柱开启和安装的步骤：

1、安装新色谱柱前应连接两通，使用新鲜洁净的水和乙腈，冲洗液相流路系统，确保流路系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。

2、取用色谱柱时要轻拿轻放，避免磕碰掉落，打开色谱柱包装盒后，要先检查色谱柱两端的死堵是否连接完好；

3、安装色谱柱前先确认色谱柱上的流向标识确定好流向后再进行安装；将色谱柱入口端连接到系统上，柱出口端先不要连接.先以0.1 mL/min流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱，然后在10分钟内将流速升至0.5mL/min，当溶剂均匀的从柱出口端流出，停止流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上这样可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡，重新启动流速，然后逐渐提高流速，至常规分析测试时所设置的柱流速。

4、使用该流动相条件平衡色谱柱，通常需要使用5-10倍柱体积的流动相，直至压力与基线稳定。

三、进行实际样品分析过程中注意事项：

1、确保流动相洁净，每隔24-48小时就应新配水相流动相，并同时更换或仔细清洗流动相溶剂瓶，以避免流动相长菌，确保实验室纯水系统工作正常。

2、确保样品不含颗粒型杂质。如样品过脏，或有微粒存在，需要考虑适合的样品制备方法。在使用样品过滤器时，确保滤膜为0.22μm，且与样品溶剂完全兼容（不发生溶解）。也可考虑使用高速离心法去除颗粒性杂质，例如3000rpm转速以上离心20分钟后，移取样品上清液进样。

3、确保样品溶液与流动相条件兼容，进样后不会发生沉淀、或溶剂不互溶情况。通常使用流动相或比流动相洗脱强度弱的溶液（即有机溶剂比例较低）溶解或稀释样品，这样可以获得优异的峰形和检测灵敏度。

4、了解色谱柱的操作使用限度。如果所使用的流动相条件、柱温、以及样品溶液条件，不利于色谱柱寿命时，请使用保护柱以延长柱寿命。

5、在使用流动相进行柱平衡之前，如果流动相中含有可能析出的缓冲盐，先使用5倍柱体积的有机溶剂-水溶液进行过渡。例如，在使用40/60甲醇/磷酸盐缓冲液流动相之前，先使用5倍柱体积的40/60甲醇/纯水溶液冲洗色谱柱。

6、在常规分析过程中，每针或间隔若干针清洗柱内可能积累的污染物。完成分析后，彻底清洗色谱柱，除去柱内缓冲盐和污染物。

7、在色谱柱使用过程中，定期进行柱效测试，记录塔板数与压力，从而追踪监控色谱柱的性能变化。柱效测试方法应固定。

8、反相色谱柱应保存于合适的高比例或100%有机相（如乙腈或甲醇）中。如色谱柱使用于高温或极端PH条件，或停用色谱柱超过72小时，用100%乙腈保存色谱柱。

9、使用原配的柱堵头，确保堵头拧紧以避免柱内溶剂挥发，取放色谱柱时避免磕碰掉落。

四、色谱柱清洗与活化再生的步骤：

1、压力升高，色谱柱峰形发生变化如出现严重拖尾、肩峰甚至峰分岔，分离度降低，这些都强烈提示色谱柱受到污染。可采用以下方式处理：

如系统接有保护柱，首先排查保护柱，进行更新替换。日常操作中，当压力升高10%或柱效降低10%时，就应考虑更换保护柱。

2、使用高比例的有机溶剂进行冲洗（注意避免盐析出，通常可使用梯度升高法，然后维持在高比例甚至100%有机溶剂条件下）。此操作通常可洗去大部分污染物。

如有机溶剂清洗不能解决问题，可采用如下方法进行色谱柱的清洗和再生。根据样品性质以及你所了解的污染物性质选择清洗方法，用20倍柱体积（即，对于4.6x250mm柱，相当于80mL）的HPLC级溶剂清洗色谱柱，将流动相温度升至35-55?C可提高清洗效率。