主题：【第十七届原创】高效液相色谱法测定腐乳中3种红曲色素的操作要点

一、样品前处理

1. 样品采集与准备
  首先要采集具有代表性的腐乳样品。如果是块状腐乳，要尽量取到不同部位的腐乳，避免只取到表面或者中心部分。把采集到的腐乳样品混合均匀后，称取一定量，比如5 - 10克（具体量可根据腐乳中红曲色素的大致含量调整），放到合适的容器里，像具塞锥形瓶就比较合适。
2. 提取
  加入适量的提取溶剂。对于红曲色素，一般可以用乙醇 - 水混合溶剂，比如70%的乙醇溶液。按照1:5 - 1:10（样品质量与溶剂体积比）的比例加入溶剂。然后密封好容器，放在振荡器上振荡提取。振荡速度不要太快，避免溶液溅出，振荡时间可以设置为30分钟到1个小时，确保红曲色素充分溶解到溶剂中。
3. 过滤与离心
  提取结束后，先用滤纸进行初步过滤，把大颗粒杂质去掉。如果滤液还是不够澄清，可以再进行离心操作。把过滤后的溶液转移到离心管中，设置离心机转速为3000 - 5000转/分钟，离心5 - 10分钟，取上清液备用。

二、高效液相色谱仪操作

1. 色谱柱选择与安装
  选择合适的色谱柱很关键。对于红曲色素的测定，C18反相柱是比较常用的。在安装色谱柱的时候，要小心谨慎。按照仪器的说明，先把柱子的一端连接到进样口，拧紧连接头，保证密封不漏气；再把另一端连接到检测器上，同样要拧紧。连接好之后，要检查整个气路系统是否通畅。
2. 流动相设置
  流动相一般采用甲醇 - 水或者乙腈 - 水的混合体系，并且可能需要添加一些酸或者缓冲盐来调节pH值。例如，可以用甲醇 - 水（60:40的比例），再加入0.1%的甲酸来调节pH值到3 - 4之间。这样的流动相体系能够使红曲色素在色谱柱上有较好的分离效果。
3. 检测波长设置
  红曲色素在可见光范围内有吸收，对于红曲红胺、红曲素、红曲红素这几种色素，检测波长可以设置在470 - 500nm之间。通过查阅相关资料或者进行预实验来确定最佳的检测波长，以获得最高的灵敏度和最好的峰形。
4. 进样操作
  用微量进样器吸取适量的样品上清液，进样量一般在1 - 10微升之间。进样的时候要快且准，保持进样的深度和角度一致，这样可以保证每次进样的重复性好。

三、结果计算与分析

1. 标准曲线制作
  要先配制一系列已知浓度的红曲红胺、红曲素、红曲红素的标准溶液。分别进样后，以标准溶液的浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线的线性关系要好，相关系数一般要达到0.99以上。
2. 样品测定与含量计算
  进样样品溶液后，根据得到的色谱峰面积，在标准曲线上查出对应的浓度。然后根据样品的称取量、提取液的体积以及进样量等因素，计算出腐乳中红曲红胺、红曲素、红曲红素的含量。在计算过程中，要注意单位的换算，确保结果的准确性。