主题：【第十一届原创】【仪器故事】使用酶标仪测定淀粉酶抑制率的方法

使用酶标仪测定α-淀粉酶抑制率方法的研究

1.实验原理

    淀粉的消化主要有α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶的参与，α-淀粉酶水解α-1,4-连接键，消化的产物主要有麦芽糖、麦芽三糖、α-糊精，这些物质的进一步消化要在小肠上靠α-葡萄糖苷酶进行，α-葡萄糖苷酶主要包含麦芽-葡糖淀粉酶与蔗糖-异麦芽糖酶，α-葡萄糖苷酶水解的产物是葡萄糖。因此，通过抑制淀粉酶或葡萄糖苷酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解与消化，减少糖分的吸收，以达到控制体内血糖浓度水平。

    本实验是针对淀粉酶水解淀粉溶液而导致溶液中浑浊度的变化，测定溶液吸光度值的变化，以抑制剂阿卡波糖作为参照标准，抑制淀粉酶的能力以阿卡波糖当量来表达。

2.实验方法与数据处理
    将空白、样品或标准抑制剂Acarbose(阿卡波糖)与α-淀粉酶溶液混合均匀，37℃保温孵育15min，然后再加入淀粉溶液，快速振荡后在660nm迅速开始测定，利用酶标仪配备软件记录吸光度OD，初始吸光度值记为f1，以后每隔一段时间测定一个点，吸光度分别记为f1, f2 …，抑制剂作用下衰减曲线下的积分面积，扣除无抑制剂的空白曲线下面积，得出抑制剂的曲线下净面积(Net AUC)。衰退曲线下面积AUC可以近似看作各梯形面积之和，可以表达为：
AUC=0.5×(f₁+f₂)×ΔT+0.5×(f₂+f₃)×ΔT+...+0.5×(f_x+f_x+1)×ΔT+...+0.5×(f_n-1 +f_n)×ΔT
=0.5×[2×(f₁ +f₂ +...+ f_n-1 +f_n)-f₁ -f_n]×ΔT
其中f_n代表第n个测定点时的吸光度，ΔT为相邻两个测定点之间的时间间隔，因本实验测定方法中ΔT设定为2min，一共有61测定点，因此该公式可以简化为：
AUC=2×(f₂+f₃+...+f₆₀)+ f₁ + f₆₁
以Acarbose当量μmol Acarbose equivalent/g (μmol AE/g)表达。

3.试剂溶液的制备
3.1 磷酸盐缓冲溶液
3.1.1 CaCl₂溶液
准确称取CaCl₂·2H₂O粉末0.25g溶于100 mL ddH₂O，即为CaCl₂溶液2500mg/L。
3.1.2缓冲溶液工作液
分别称取8.9g  Na₂HPO₄·2H₂O与6.9g  NaH₂PO₄·H₂O于1000 mL容量瓶中，再量取CaCl₂溶液20 mL，混合后用ddH₂O定容至1000 mL，这样得到0.1M，pH 6.9的缓冲溶液，冰箱下贮存。
3.2 玉米淀粉溶液
玉米淀粉储备液：准确称取约1.0000g大米淀粉，加入50mL缓冲液，磁力搅拌数分钟后置于78℃左右水浴10分钟，于磁力搅拌器中搅拌自然冷却至室温，即为2%的淀粉溶液（20mg/mL）；
玉米淀粉工作液：将储备液用缓冲溶液依次分别稀释至1.0-10mg/mL的工作液。
3.3 α-淀粉酶溶液
准确称取α-淀粉酶固体粉末（23U/mg）40mg，用缓冲溶液定容至10 mL，即为4mg /mL的α-淀粉酶储备液，再依次稀释至0.2、0.1、0.05、0.04、0.025 mg /mL的α-淀粉酶工作液。
3.4 Acarbose标准溶液的配制
0.1g  acarbose定容到100 mL磷酸缓冲液中，得到1mg /mL贮备液，然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成的工作液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg /mL。
4.研究步骤

4.1 淀粉溶液的线性范围
    由于本实验是对样品中浑浊度的变化来进行，而对浑浊度的测量不像紫外-可见分光光度计那样有理想的波长以及会出现明显的特征峰，根据文献大多数浑浊度的测量波长在620-700nm之间。为了确定玉米淀粉溶液的线性，我们选择玉米淀粉溶液的浓度在0-10mg/mL，波长选择660、700、800、900、970nm进行比较。
使用玉米淀粉工作液0-10mg/mL，分别在660nm、700nm、800nm、900nm、970nm波长下测定其吸光度,重复测定3次。不同波长下淀粉溶液浓度与其OD值之间的线性关系图如下：

4.2 淀粉酶的活力
    将20μL的缓冲溶液与20μL的不同浓度α-淀粉酶溶液混合均匀，37℃保温孵育15min，然后再加入60μL的2%淀粉溶液，快速振荡后在660nm迅速开始测定其吸光度值。
以不同浓度的淀粉酶浓度0.4、0.2、0.1、0.05、0.04、0.025 mg /mL，底物选择20mg/mL的淀粉溶液进行试验，在660nm下测定其吸光度值的变化曲线。
660nm下其吸光度值的衰退曲线图：

从上图，在660nm波长下，不同淀粉酶浓度使淀粉溶液的吸光度下降，而且淀粉酶浓度越大，吸光度下降的越快。AUC与淀粉酶浓度成负相关关系，随着酶浓度的增大，曲线下面积AUC逐渐减小。

4.3 抑制剂阿卡波糖活力
    采用不同浓度的阿卡波糖浓度0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg /mL分别进行试验（n=3），淀粉溶液的浓度选择20mg/mL，淀粉酶浓度选择0.2mg /mL。
通过试验，各个不同浓度的阿卡波糖抑制曲线图如下：

从上图看出，阿卡波糖浓度 在0.01-0.05 mg /mL之间与其曲线下净面积Net AUC的线性较好，相关系数R²=0.9972。

4.4 线性研究
    以不同浓度的阿卡波糖0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07mg /mL分别进行试验，淀粉溶液的浓度选择20mg/mL，淀粉酶浓度选择0.2mg /mL。
通过试验，各个不同浓度的阿卡波糖抑制曲线图如下：

不同浓度的阿卡波糖与其曲线下净面积Net AUC的线性关系图如下（重复试验7次）：

4.5 提取溶剂的影响
对提取溶剂（丙酮：乙醇：水的混合溶剂）进行研究，即以提取溶剂代替缓冲溶液进行试验，并与缓冲溶液进行比较。

其中：
BLK——20μL缓冲溶液+20μL淀粉酶+60μL淀粉；
BLK1——20μL提取溶剂+20μL淀粉酶+60μL淀粉；
Emp——40μL缓冲溶液+60μL淀粉；
Emp1——40μL提取溶剂+60μL淀粉。

通过对提取溶剂稀释10、100、1000、10000倍后再进行同样试验（如下图）：

从图上看出，通过对提取溶剂稀释10、100、1000、10000倍后试验，基本对测定无影响。

4.6 样品检测

  将样品提取液代替阿卡波糖加入到淀粉酶溶液中，37℃保温孵育15min，然后再加入淀粉溶液，快速振荡后在660nm迅速开始测定。通过计算得出样品中的AE（阿卡波糖当量）。也可以通过比较抑制率IC50，来判断样品中的淀粉酶抑制率强弱。

5.小结
    通过以上对α-淀粉酶抑制率试验方法进行研究，实验表明，该方法适用于样品中α-淀粉酶抑制率的筛选。

注意事项：

1.  标准溶液或者样品与淀粉酶溶液混合后需在37℃保温孵育15min，再加入淀粉溶液；

2.  加入淀粉溶液让后需要快速振荡后在660nm迅速开始测定；

6.参考文献
1. LEE WAH KOH, LIN LING WONG, YING YAN LOO, STEFAN KASAPIS, AND DEJIAN HUANG.  J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 148-154
2. ALVIN ENG KIAT LOO AND DEJIAN HUANG.  J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 9805-9810
3. Elena Lo Piparo, Holger Scheib,Nathalie Frei, Gary Williamson, Martin Grigorov, and Chieh Jason Chou. J. Med. Chem. 2008, 51, 3555-3561
4. TOSHIRO MATSUI, TAKASHI TANAKA, SATOMI TAMURA, ASAMI TOSHIMA,KEI TAMAYA,YUJI MIYATA,KAZUNARI TANAKA, AND KIYOSHI MATSUMOTO.  J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 99-105