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主题：【第七届原创】酶活力测定

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rosmarinic
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发表于：2014/10/17 16:16:57 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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酶活力的测定方法

（1）葡萄糖标准曲线的绘制

取8只洗净烘干的20 mL具塞刻度试管，编号后分别吸取0.0 mL ~ 1.4 mL葡萄糖标液用蒸馏水定容至2 mL，配置成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入1.5 mLDNS溶液，摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至20 mL，充分混匀。在540 nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的吸光度值并记录结果。以葡萄糖含量为横坐标，以对应的吸光度值为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线。

（2）滤纸酶活力的测定

取4支洗净烘干的20 mL具塞刻度试管，编号后各加入0.5 mL酶液和1.5 mL 0.05  mol/L pH 4.5的柠檬酸缓冲液，向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5 min ~ 10 min，再各加入滤纸条50 mg（定量滤纸，约1 cm × 6 cm），50℃水浴中保温1 h后取出立即向2、3、4号试管中各加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至20 mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540 nm波长下测定2、3、4号试管液的吸光度值并记录结果。

根据3个重复吸光度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力（U/g）。在上述条件下，每小时由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

                               



式中：U—滤纸酶活力（U/g）；          M—葡萄糖含量（mg）；

V1—酶液定容总体积（mL）；      K—5.56为1 mg葡萄糖的μmol数；

V2—反应液中酶液加入量（mL）；  m—样品重（g）；

T—时间（h）。

酶活力的测定结果

（1）葡萄糖标准曲线的绘制

采用分光光度计法，以葡萄糖在其最大吸收波长540 nm处绘制标准曲线，如图所示。




求得葡萄糖的回归方程为：

Y=0.7895X-0.0084    R2=0.9994



葡萄糖含量在0.00 mg ~ 1.40 mg范围内呈线性关系。

（2）酶活力的测定（滤纸法）

根据上式计算，滤纸法酶活力为5000 U/g，与酶制剂公司所提供酶活相一致。
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2014/10/17 17:19:49 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你测的是什么的酶活?
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rosmarinic
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2014/10/17 17:37:38 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由richies发表： 你测的是什么的酶活?
纤维素酶
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2014/10/17 21:37:26 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
请问DNS是什么？
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richies
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2014/10/17 22:09:08 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 symmacros(jimzhu) 发表:

请问DNS是什么？


应该是二硝基水杨酸吧
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2014/10/17 22:15:58 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
真没做过纤维素酶测定,好像是一类酶的总和吧
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rosmarinic
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2014/10/17 22:31:35 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由richies发表：
原文由 symmacros(jimzhu) 发表:

请问DNS是什么？


应该是二硝基水杨酸吧
对的
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花开见我
cai008
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2014/10/18 21:22:34 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
其原理：

纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。
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rosmarinic
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2014/10/18 22:51:36 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由cai008发表： 其原理：

纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。
感谢补充
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9999youran
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2014/10/19 10:43:35 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
学习了！！
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夏天的雪
bingwang228
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2014/10/20 9:38:45 11楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
引起酶活力降低的因素有哪些
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